1.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案：例如對(duì)樣品、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的一個(gè)實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)  

    2.引物和探針的設(shè)計(jì)和合成  

    3.抽提RNA，測(cè)定提取的RNA的濃度  

    4.反轉(zhuǎn)錄PCR  

    5.定量PCR  

    6.數(shù)據(jù)分析  

    在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)驗(yàn)的過(guò)程中，PCR的擴(kuò)增效率是一個(gè)非常重要的影響因素，因?yàn)槎縋CR原理的理論方程是基于擴(kuò)增效率zui大值1，因此高的擴(kuò)增效率能保證定量PCR實(shí)驗(yàn)的性及重復(fù)性，影響PCR擴(kuò)增效率主要有以下幾個(gè)方面：1，擴(kuò)增子的長(zhǎng)度；2，擴(kuò)增子的GC含量；3，擴(kuò)增子、引物和探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)；4，PCR反應(yīng)各組分的濃度；5，RNA或者cDNA的純度。  

    進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須設(shè)計(jì)好引物和探針，除了能獲得高的擴(kuò)增效率外，對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性、消除基因組DNA的擴(kuò)增及提高擴(kuò)增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對(duì)18SRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光曲線圖（反應(yīng)條件和模板都相同）。